¹ ИБМХ, Москва, Российская Федерация

² ОИВТ РАН, Москва, Российская Федерация

³ ФПТН, Москва, Российская Федерация

⁴ МГУ, Москва, Российская Федерация

⁵ ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва, Российская Федерация

Разработана экспериментальная установка биосенсора с чувствительным элементом на базе биомембраны из фосфолипида 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфохолина для изучения ее взаимодействия с мембранным белком-цитохромом b₅. Проведены исследования электрофизических характеристик биомембраны. Созданная установка позволяет регистрировать взаимодействие биомембраны (представляющей собой фосфолипидный бислой, сформированный в биосенсоре) с мембранным белком посредством измерения электрической проводимости биомембраны. Электрическую проводимость мембраны определяли при наличии белка и его отсутствии. Экспериментально продемонстрировано, что такой биосенсор позволяет определять взаимодействие цитохрома b₅ с фосфолипидной мембраной в реальном времени. C использованием установки определено, что полноразмерный белок цитохром b₅ (d-b₅), содержащий в структуре гидрофобный домен, существенно влияет на проводимость мембраны, приводя к возникновению каналов проводимости. В случае отсутствия у цитохрома b₅ мембранного фрагмента (t-b₅) взаимодействие белка с липидным слоем практически не наблюдалось. Полученные результаты можно использовать при создании биосенсоров на базе липидных слоев для моделирования взаимодействия белков с липидными мембранами в организме человека

Ключевые слова. Биосенсор, липидные мембраны, цитохром b5, электропроводность, фосфолипиды

Введение. В последнее время актуальной задачей является создание электрохимических биосенсоров для изучения взаимодействия липидных структур с белками. Это связано с тем, что такие биосенсоры позволяют напрямую исследовать взаимодействие липидных бислоев с мембранными белками, моделируя процессы, которые происходят в живых клетках.

В живых организмах клеточная мембрана отделяет внутреннюю среду клетки от внеклеточной среды, обеспечивая контроль транспорта различных соединений в клетку [1] и сообщение клетки с окружающей средой [2]. Мембрана служит барьером, препятствующим прониканию нежелательных веществ в клетку. Клеточные мембраны представляют собой сложные структуры, содержащие липиды и белки [3]. Различные мембраны включают в себя белки и липиды разных типов [1] и характеризуются разным соотношением белок/липид [3]. Эти факты объясняют различие функций мембран [4]. Кроме того, взаимодействие клеточной мембраны с белками имеет решающее значение при изучении развития патологий у человека, например, болезни Альцгеймера [5]. Поэтому исследование взаимодействий белок–липид является одной из ключевых задач современной биомедицины.

Для изучения взаимодействия белков с биомембранами последние часто моделируют с использованием искусственных липидных бислойных мембран [6, 7]. С химической точки зрения большинство мембранообразующих липидов относятся к фосфолипидам [3]. Соответственно, тщательное изучение взаимодействий фосфолипидных мембран с белками обеспечивает понимание процессов в клеточных структурах организма [3].

Включение белков в искусственные фосфолипидные мембраны изучается различными методами, которые основаны на флуоресцентной спектроскопии [8], двумерной инфракрасной корреляционной спектроскопии [9], рамановской спектроскопии [10] и т. д. В исследованиях взаимодействия белок–липидная мембрана используется оптическая улавливающая конфокальная рамановская микроскопия [11]. Электрические и электрохимические методы также применяются для исследования взаимодействий белок–липидная мембрана [1]. В связи с этим подчеркнута важность подходов с использованием одной молекулы для исследования белков и ферментов [12]. Такие подходы позволяют преодолеть ограничения, связанные с усреднением измеряемых параметров по большому молекулярному ансамблю [12]. При исследовании отдельных молекул белков и ферментов применяется метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) [13]. Однако для исследования белков с липидными бислойными мембранами использование АСМ требует подготовки поддерживаемых фосфолипидных бислоев (ПФЛБ) [14, 15]. При рассмотрении ПФЛБ кроме взаимодействий белок–липид задействованы взаимодействия исследуемых липидов и белков с поверхностью подложки для АСМ. Таким образом, в случае ПФЛБ условия измерения далеки от нативных: взаимодействия липид–субстрат и белок–субстрат могут искажать истинную картину липид-белкового взаимодействия. Эту трудность можно преодолеть электрическими методами на основе пор, которые не требуют приготовления ПФЛБ и, следовательно, позволяют изучать белок-липидные взаимодействия в условиях, близких к нативным. Электрические методы на основе пор дают возможность различать отдельные события взаимодействия белка с мембраной [16], что представляет собой многообещающий подход к исследованию отдельных молекул.

В организмах млекопитающих цитохром b5 относится к микросомальным ферментным белкам. У человека цитохром b5 регулирует активность ряда цитохромов P450, участвуя в цитохром P450-опосредованном метаболизме различных ксенобиотиков, к которым относится большинство лекарственных препаратов [17]. Цитохром b5 также действует как окислительно-восстановительный партнер цитохрома P450 2B4 [18]. Кроме того, цитохром b5 участвует в синтезе андрогенов [19], а именно регулирует активность цитохрома P450c17, который рассматривается как целевой фермент при лечении рака простаты [19]. Полноразмерный фермент (называемый формой d-b5) состоит из двух доменов: 1) каталитически активного полярного домена; 2) гидрофобного неполярного. Последний используется для встраивания в мембрану [10, 20]. Каталитически активный полярный домен может быть выделен протеолитическим перевариванием микросомальных мембран и упоминается как трипсин-солюбилизированный__ цитохром b5 (t-b5). Для микросомального d-b5 печени молекулярная масса мономера составляет 16 кДа, для агрегата d-b5 — ~ 100 кДа, для его формы t-b5 — ~ 11 кДа [10].

Взаимодействие цитохрома P450 и его партнеров, включая цитохром b5, с фосфолипидной мембраной рассмотрено в [21, 22]. Организация этой ферментной системы очень сложна. Поэтому механизм взаимодействия системы цитохрома P450 с фосфолипидными мембранами до сих пор остается недостаточно изученным и для его понимания требуются дальнейшие исследования.

В настоящей работе предложен биосенсор на базе липидного бислоя. С его использованием проведены измерения проводимости этого бислоя с целью изучить взаимодействие цитохрома b5 с фосфолипидной мембраной из 1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфохолина (ДФФХ) и влияние гидрофобного неполярного домена фермента на это взаимодействие. Разработанный биосенсор включает в себя жидкостную ячейку, разделенную на две камеры перегородкой с отверстием, в котором формировали липидный бислой. Экспериментально выполнена проверка электропроводности липидной бислойной мембраны. Изготовленная таким образом кювета характеризуется отсутствием проводимости через липидную биомембрану, в то время как полноразмерный d-b5, добавленный в одну из камер, может взаимодействовать с мембраной из ДФФХ, что регистрируется по увеличению ее проводимости. Напротив, t-b5 не привел к какому-либо изменению проводимости мембраны. Полученные данные важны для моделирования взаимодействия мембранных белков с фосфолипидными мембранами. Результаты могут быть использованы в дальнейших исследованиях, направленных на понимание механизма взаимодействия ферментов, относящихся к системе цитохрома P450, с клеточными мембранами.

формате PDF (378Кб)

[1] Khan M.S., Dosoky N.S., Williams J.D. Engineering lipid bilayer membranes for protein studies. Int. J. Mol. Sci., 2013, vol. 14, iss. 11, pp. 21561--21597. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms141121561

[2] Robinson M., Filice C.T., McRae D.M., et al. Atomic force microscopy and other scanning probe microscopy methods to study nanoscale domains in model lipid membranes. Adv. Phys. X, 2023, vol. 8, iss. 1, art. 2197623. DOI: https://doi.org/10.1080/23746149.2023.2197623

[3] Singer S.J. Architecture and topography of biologic membranes. Hosp. Pract., 1973, vol. 8, no. 5, pp. 81--90. DOI: https://doi.org/10.1080/21548331.1973.11707910

[4] Carey P.R. Biochemical applications of Raman and Resonance spectroscopies. Academic Press, 1982.

[5] Viles J.H. Imaging amyloid-β membrane interactions: ion-channel pores and lipid-bilayer permeability in Alzheimer’s disease. Angew. Chem. Int. Ed., 2023, vol. 62, no. 25, art. e202215785. DOI: https://doi.org/10.1002/anie.202215785

[6] Rascol E., Devoisselle J.-M., Chopineau J. The relevance of membrane models to understand nanoparticles--cell membrane interactions. Nanoscale, 2016, vol. 8, no. 9, pp. 4780--4798. DOI: https://doi.org/10.1039/C5NR07954C

[7] Broda J., Setzler J., Leifert A., et al. Ligand-lipid and ligand-core affinity control the interaction of gold nanoparticles with artificial lipid bilayers and cell membranes. Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. 2016, vol. 12, no. 5, pp. 1409--1419. DOI: https://doi.org/10.1016/j.nano.2015.12.384

[8] Tuominen E.K.J., Wallace C.J.A., Kinnunen P.K.J. Phospholipid-cytochrome c interaction: evidence for the extended lipid anchorage. J. Biol. Chem., 2002, vol. 277, no. 11, pp. 8822--8826. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M200056200

[9] Bernabeu A., Contreras L.M., Villalain J. Two-dimensional infrared correlation spectroscopy study of the interaction of oxidized and reduced cytochrome c with phospholipid model membranes. Biochim. Biophys. Acta Biomembr., 2007, vol. 1768, iss. 10, pp. 2409--2420. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2007.05.002

[10] Archakov A.I., Bachmanova G.I. Cytochrome P450 and active oxygen. Taylor & Francis, 1990.

[11] Belikova N.A., Vladimirov Yu.A., Osipov O.N., et al. Peroxidase activity and structural transitions of cytochrome c bound to cardiolipin-containing membranes. Biochemistry, 2006, vol. 45, iss. 15, pp. 4998--5009. DOI: https://doi.org/10.1021/bi0525573

[12] Cecconi C., Shank E.A., Bustamante C., et al. Direct observation of the three-state folding of a single protein molecule. Science, 2005, vol. 309, pp. 2057--2060. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1116702

[13] Kuznetsov V.Yu., Ivanov Yu.D., Archakov A.I. Atomic force microscopy revelation of molecular complexes in the multiprotein cytochrome P450 2B4-containing system. Proteomics, 2004, vol. 4, iss. 8, pp. 2390--2396. DOI: https://doi.org/10.1002/pmic.200300751

[14] Lv Z., Banerjee S., Zagorski K., et al. Supported lipid bilayers for atomic force microscopy studies. In: Lyubchenko Y. (eds). Nanoscale Imaging. Methods in Molecular Biology, vol. 1814. New York, NY, Humana Press, 2018, pp. 129--143. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8591-3_8

[15] Mingeot-Leclercq M.P., Deleu M., Brasseur R., et al. Atomic force microscopy of supported lipid bilayers. Nat. Protoc., 2008, vol. 3, pp. 1654--1659. DOI: https://doi.org/10.1038/nprot.2008.149

[16] Wu J., Yamashita T., Hamilton A.D., et al. Single-molecule nanopore dielectrophoretic trapping of a-synuclein with lipid membranes. Cell Rep. Phys. Sci., 2023, vol. 4, art. 101243. DOI: https://doi.org/10.1016/j.xcrp.2022.101243

[17] Zhang H., Gao N., Liu T., et al. Effect of cytochrome b₅ content on the activity of polymorphic CYP1A2, 2B6, and 2E1 in human liver microsomes. PLoS ONE, 2015, vol. 10, no. 6, art. e0128547. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0128547

[18] Zhang M., Le Clair S.V., Huang R., et al. Insights into the role of substrates on the interaction between cytochrome b₅ and cytochrome P450 2B4 by NMR. Sci. Rep., 2015, vol. 5, art. 8392. DOI: https://doi.org/10.1038/srep08392

[19] Simonov A.N., Holien J.K., Yeung J.C.I., et al. Mechanistic scrutiny identifies a kinetic role for cytochrome b₅ regulation of human cytochrome P450c17 (CYP17A1, P450 17A1). PLoS ONE, 2015, vol. 10, no. 11, art. e0141252. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0141252

[20] Kleinfeld A.M., Lukacovic M.F. Energy-transfer study of cytochrome b₅ using the anthroyloxy fatty acid membrane probes. Biochemistry, 1985, vol. 24, iss. 8, pp. 1883--1890. DOI: https://doi.org/10.1021/bi00329a012

[21] Scott E.E., Wolf C.R., Otyepka M., et al. The role of protein-protein and protein-membrane interactions on P450 function. Drug Metab. Dispos., 2016, vol. 44, no. 4, pp. 576--590. DOI: https://doi.org/10.1124/dmd.115.068569

[22] Mustafa G., Nandekar P.P., Bruce N.J., et al. Differing membrane interactions of two highly similar drug-metabolizing cytochrome P450 isoforms: CYP 2C9 and CYP 2C19 Int. J. Mol. Sci., 2019, vol. 20, iss. 18, art. 4328. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms20184328

[23] Spatz L., Strittmatter P. A form of cytochrome b₅ that contains an additional hydrophobic sequence of 40 amino acid residues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1971, vol. 68, no. 5, pp. 1042--1046. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.68.5.1042

[24] Omura T., Takesue S. A new method for simultaneous purification of cytochrome b₅ and NADH-cytochrome b₅ reductase from rat liver microsomes. J. Biochem., 1970, vol. 67, iss. 2, pp. 249--257. DOI: https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.jbchem.a129248

[25] Bachmanova G.I., Kanaeva I.P., Stepanova N.V., et al. [Role of cytochrome b₅ in microsomal soluble reconstituted monooxygenase system]. Abstracts of 9th ICCP450, Zurich, 1995, p. 232.

[26] Johnson M.E., Simon S., Kauffman J.W., et al. A synthetic lecithin containing branched-chain fatty acids: physical properties and membrane studies. Biochim. Biophys. Acta Biomembr., 1973, vol. 291, iss. 3, pp. 587--591. DOI: https://doi.org/10.1016/0005-2736(73)90463-X

[27] Wang S., Larson R.G. Water channel formation and ion transport in linear and branched lipid bilayers. Phys. Chem. Chem. Phys., 2014, vol. 16, no. 16, pp. 7251--7262. DOI: https://doi.org/10.1039/C3CP55116D

[28] Tristram-Nagle S., Kim D.J., Akhunzada N., et al. Structure and water permeability of fully hydrated diphytanoylPC. Chem. Phys. Lipids, 2010, vol. 163, iss. 6, pp. 630--637. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chemphyslip.2010.04.011

[29] Vorobyov I., Olson T.E., Kim J.H., et al. Ion-induced defect permeation of lipid membranes. Biophys. J., 2014, vol. 106, iss. 3, pp. 586--597. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.bpj.2013.12.027

[30] Xiang T.X., Anderson B.D. Influence of a transmembrane protein on the permeability of small molecules across lipid membranes. J. Membrane Biol., 2000, vol. 173, iss. 3, pp. 187--201. DOI: https://doi.org/10.1007/s002320001019

Работа выполнена при поддержке Минобрнауки России (соглашение № 075-15-2024-643)

Аблеев А.Н., Шумов И.Д., Шумянцева В.В. и др. Создание нанобиосенсора на базе липидной биомембраны для исследования ее взаимодействия с белком цитохромом b₅. Вестник МГТУ им. Н.Э. Баумана. Сер. Естественные науки, 2026, № 1 (124), с. 97--117. EDN: VOTYNO