^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 20, 26} Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, Москва, Россия

^{1, 20, 21, 22, 23} Объединённый институт высоких температур Российской академии наук, Москва, Россия

¹⁰ Институт физики полупроводников им. А. В. Ржанова Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибиpск, Россия

¹¹ Новосибирский завод полупроводниковых приборов Восток, Новосибиpск, Россия

^{12, 13, 14} Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н. Н. Блохина Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия

^{15, 16} Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), Москва, Россия

^{17, 18} Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации Москва, Россия

¹⁹ Фонд перспективных технологий и новаций, Москва, Россия

²⁴ Рекламно-издательский центр «Техносфера», Москва, Россия

²⁵ Национальный исследовательский ядерный университет МИФИ, Москва, Россия

Аннотация. Почечно-клеточный рак – наиболее распространённая форма рака почки (более 90 % всех онкологических патологий почки). На ранней стадии развития почечно-клеточный рак может протекать бессимптомно, что существенно затрудняет диагностику. Существующие методы диагностики почечно-клеточного рака не позволяют своевременно выявлять это заболевание на ранних стадиях, поэтому необходимо разработать эффективные и неинвазивные методы диагностики по обнаруживаемым в крови биологическим макромолекулам – биомаркерам рака данного типа. В качестве таких биологических макромолекул предложено использовать малые ядрышковые рибонуклеиновые кислоты. В настоящем исследовании спроектирован и изготовлен SiNW-биосенсор для прямого обнаружения в крови малой ядрышковой рибонуклеиновой кислоты SNORA77, ассоциированной с почечно-клеточным раком. Ключевым элементом разработанного SiNW-биосенсора является нанопроволочный чип на основе структур «кремний-на-изоляторе». Чип изготовлен по технологии, аналогичной Smart Cut, и содержит массив из кремниевых нанопроволок с проводимостью n-типа, на поверхность которых ковалентно иммобилизованы олигодезоксирибонуклеотидные зонды. Для обеспечения специфичности проводимого анализа нуклеотидная последовательность иммобилизованных олигодезоксирибонуклеотидных зондов комплементарна целевой детектируемой последовательности малой ядрышковой рибонуклеиновой кислоты SNORA77. Проанализированы очищенные буферные растворы с различными концентрациями синтетических олигодезоксирибонуклеотидных зондов, последовательность которых аналогична целевой детектируемой последовательности SNORA77. С помощью разработанного SiNW-биосенсора определён предел обнаружения SNORA77, составивший порядка 10^–17 М. В образце, выделенном из плазмы крови пациента с подтверждённым диагнозом «почечно-клеточный рак», SiNW-биосенсор позволил выявить повышенный уровень SNORA77 по сравнению с контрольным образцом, выделенным из плазмы крови пациента с заболеванием неонкологической природы. Результаты исследования будут полезны для дальнейшей разработки систем ранней диагностики почечно-клеточного рака.

Ключевые слова: биосенсор, кремниевая нанопроволока, малые ядрышковые рибонуклеиновые кислоты, биомаркер, почечно-клеточный рак

Введение. Почечно-клеточный рак (ПКР) возникает в почечном эпителии и является наиболее распространённой формой рака почки – более 90 % всех злокачественных новообразований почки [1, 2]. Соотношение заболеваемости ПКР среди мужчин и женщин составляет 1,5:1, при этом ПКР чаще встречается среди старшей возрастной группы, а пик заболеваемости приходится на возраст 60–70 лет [3, 4]. Наиболее распространённым гистологическим типом является светлоклеточный ПКР, на который приходится 75–85 % всех случаев ПКР [5]. На ранней стадии развития ПКР может протекать бессимптомно, что существенно затрудняет диагностику данного заболевания [6]. Например, классическая триада симптомов ПКР – гематурия, боль и образования в животе – проявляется редко и менее чем у 10 % пациентов [7, 8]. Более того, большинство случаев ПКР выявляются случайно при обследовании органов брюшной полости методами визуализации – магнитно-резонансной и/или компьютерной томографии, или при ультразвуковой диагностике [9–11]. Так, в когортном исследовании [12] показано, что ПКР был выявлен случайно у 60 % пациентов. Таким образом, для своевременного выявления ПКР требуются простые, эффективные и неинвазивные методы диагностики, к которым можно отнести методы на основе обнаружения (детекции) биологических макромолекул — биомаркеров ПКР.

В настоящее время исследуется возможность использования малых ядрышковых рибонуклеиновых кислот (РНК) в качестве биомаркеров онкологических заболеваний малые ядрышковые рибонуклеиновые кислоты (РНК). Малые ядрышковые РНК являются короткими некодирующими неполиаденилированными РНК длиной 60–300 нуклеотидов. Эти РНК в основном локализованы в ядрышках и присутствуют в эукариотических организмах [13, 14]. Малые ядрышковые РНК участвуют в процессинге рибосомной РНК путём 2′-O-метилирования и псевдоуридилирования молекул рибосомной РНК, соответственно [14]. В последние годы появляется всё больше данных, свидетельствующих о том, что дисрегуляция малых ядрышковых РНК связана с онкогенезом, влияя на пролиферацию, инвазию и миграцию опухолевых клеток [14]. Например, малая ядрышковая РНК SNORD104 при раке эндометрия ингибирует апоптоз и способствует росту опухоли [15]. Высокий уровень экспрессии малой ядрышковой РНК SNORA77 коррелирует с плохой выживаемостью пациентов с ПКР [16]. А в связи с тем, что малые ядрышковые РНК экспрессируются в стабильном состоянии в крови и других жидкостях организма [13, 17], эти РНК являются перспективными биомаркерами для диагностики и прогнозирования ПКР.

К распространённым методам обнаружения малых ядрышковых РНК относятся полимеразная цепная реакция и нозерн-блоттинг. К недостаткам применения полимеразной цепной реакции для выявления РНК-мишеней относятся требования к квалификации оператора и инфраструктуре лаборатории и вероятность получения ложноположительных результатов вследствие контаминации образца при ненадлежащей организации диагностического процесса [18, 19], а также длительность и сложность диагностической процедуры (использование дополнительных меток) [18]. Амплификация может привести к неоднозначной интерпретации результатов, так как случайная контаминация образца может повлечь за собой амплификацию молекул-контаминантов. Использование меток усложняет процедуру анализа и увеличивает его длительность. Нозерн-блоттинг – многоэтапная и достаточно время- и трудозатратная процедура. Данный анализ имеет низкую чувствительность, а также требует использования меченых зондов и относительно большого количества исходного материала [19, 20]. Нозерн-блоттинг также чувствителен к контаминации, вследствие которой может происходить деградация РНК [20]. Таким образом, требуются простой и эффективный высокочувствительный метод обнаружения малых ядрышковых РНК в лабораторной практике и устройство, реализующее данный метод.

В этой связи SiNW-биосенсоры привлекательны из-за их селективности, высокой чувствительности, возможностей обнаружения целевых молекул в реальном времени, а также отсутствия трудоёмких манипуляций [21]. Помимо этого, SiNW-биосенсоры, основанные на полевых транзисторах, позволяют напрямую преобразовывать взаимодействие с аналитами, происходящее на поверхности сенсора, в читаемый сигнал, что позволяет исключить использование меток [21]. Принцип работы SiNW-биосенсора n-типа заключается в уменьшении проводимости сенсорных элементов биосенсора, за счет адсорбции на их поверхности отрицательно заряженных биомолекул-мишеней [22]. К настоящему времени разработаны биосенсоры с кремниевыми нанопроволоками (SiNW-биосенсоры), предназначенные для обнаружения молекул белков [23, 24] и нуклеиновых кислот [25–27] (а именно, микроРНК [25] и кольцевых РНК [26, 27]), которые являются биомаркерами различных заболеваний, а также вирусных частиц [28, 29]. В современной специальной литературе авторы настоящей статьи не нашли работ, описывающих создание таких биосенсоров для детекции малых ядрышковых РНК – перспективных биомаркеров онкологических заболеваний. Таким образом, важным направлением развития измерительной и аналитической аппаратуры является разработка SiNW-биосенсоров для обнаружения малых ядрышковых РНК, ассоциированных с развитием онкологических заболеваний, в том числе и ПКР.

Цель настоящего исследования – разработка SiNW- биосенсора для обнаружения малой ядрышковой РНК SNORA77, проверка его применимости для выявления повышенного уровня этой РНК в крови пациента с диагнозом «опухоль левой почки» на ранней стадии в реальном времени без использования меток, а также определение нижнего концентрационного предела обнаружения целевой последовательности SNORA77 с помощью этого биосенсора. Разработанный SiNW-биосенсор должен выявлять повышенный уровень SNORA77 в образцах плазмы крови пациента с подтверждённым диагнозом ПКР по сравнению с контрольным образцом, полученным от пациента с заболеванием неонкологической природы (мочекаменной болезнью).

формате PDF (1136Кб)

Иванов Ю. Д., Голдаева К. В., Неведрова Е. Д. и др. Ранняя диагностика почечно-клеточного рака: использование нанопроволочного биосенсора для обнаружения малой ядрышковой рибонуклеиновой кислоты SNORA77 в крови пациента. Измерительная техника, 74(5), 77–87 (2025). https://doi.org/10.32446/0368-1025it.2025-5-77-87