1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича" (ИБМХ), Москва, Россия

² Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Объединенный институт высоких температур Российской академии наук (ОИВТ РАН), Москва, Россия

³ Фонд перспективных технологий и новаций (ФПТН), Москва, Россия

⁴ Московский государственный университет, Факультет вычислительной математики и кибернетики, Москва, Россия

⁵ ООО "Научно-производственное объединение “КУРС”, Московская обл., г. Долгопрудный, Россия

⁶ Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии — МВА имени К.И. Скрябина, Москва, Россия

⁷ Национальный исследовательский ядерный университет МИФИ (НИЯУ МИФИ), Москва, Россия

⁸ Институт урологии и репродуктивного здоровья человека, ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва, Россия

Аннотация. Методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) и спектрофотометрии (СФ) исследован эффект воздействия воды, подвергнутой кавитации, на фермент пероксидазы хрена (ПХ). Методом АСМ обнаружено существенное изменение адсорбции ПХ на свежесколотой слюде после выдержки раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации, по сравнению с контрольным образцом фермента. По данным СФ, ферментативная активность ПХ при этом не изменялась. Обнаруженный эффект полезно принимать во внимание при работе с ферментами на промышленном и исследовательском оборудовании, в котором может иметь место возникновение кавитации в потоке водной среды.

Ключевые слова: пероксидаза хрена, кавитация, адсорбция фермента

Вода является основным компонентом живых систем [1]. Вследствие этого, вода широко используется как в биотехнологии, так и в исследованиях в области биомедицины как в качестве основного компонента обрабатываемых/исследуемых сред, так и в качестве теплоносителя [2, 3]. Так, в настоящее время разрабатываются технологии на базе высокопроизводительных систем очистки воды, а также организации терморегуляции и приготовления растворов на базе гидродинамических генераторов. Использование кавитационных генераторов для этих целей является эффективным и малоэнергоемким [4–6].

Ранее было показано, что кавитационная обработка воды приводит к изменению ее физико-химических свойств (электропроводности, окислительно-восстановительного потенциала и других параметров) [6]. Соответственно, использование такой воды в биомедицинском исследовательском либо в биотехнологическом оборудовании предполагает возможное влияние этой воды на свойства используемых в этом оборудовании биологических макромолекул (в частности, ферментов).

Интересно отметить, что ранее на примере пероксидазы хрена (ПХ) было экспериментально продемонстрировано влияние движения воды [7, 8] и неводной жидкости (глицерина) на свойства фермента [9–11]. В случае неводной жидкости (глицерина) было также обнаружено влияние движения жидкости на свойства ПХ в случае, когда поток глицерина был остановлен, но все равно наблюдалось влияние на фермент [12], а также наличие пост-эффекта движения неводной жидкости при ее движении во входной [13] и выходной [14] прямолинейных секций змеевикового теплообменника. Помимо этого, электромагнитные поля также оказывают заметное влияние на физико-химические свойства ПХ [15–25].

В настоящей работе исследовано влияние воды, подвергнутой кавитации, на свойства фермента на примере ПХ. Исследование проводили как методом АСМ на уровне единичных молекул фермента, так и методом спектрофотометрии (СФ). Было показано, что инкубация пробирки с раствором ПХ в воде, подвергнутой кавитации (кавитационной/кавитированной воде), приводит к существенному изменению адсорбционной способности фермента на поверхность свежесколотой слюды, а именно, к меньшей адсорбции белка по сравнению с контрольными образцами, не подвергнутыми инкубации в кавитационной воде. Более того, было продемонстрировано существование пост-эффекта от кавитационной воды на адсорбцию ПХ. Методом СФ было обнаружено, что ферментативная активность ПХ в реакции окисления его субстрата (2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоната), АБТС) в присутствии H₂O₂ не изменялась ни во время инкубации раствора фермента в воде, подвергнутой кавитации, ни после удаления этой воды.

Аналогично работам [7–2 5], в настоящей работе использовали белок ПХ, выделенный из хрена (Sigma, Cat. #6782). 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат) (АБТС) был также приобретен в Sigma (Cat. #A-1888). Пероксид водорода (H₂O₂, ч.д.а.), лимонная кислота (ос.ч.) и однозамещенный фосфат натрия (Na₂HPO₄, ч.д.а.) были приобретены в Реахим (Москва). 2 мМ фосфатно-солевой буфер в модификации Дульбекко (ФСБ-Д; pH 7,4) готовили путем растворения готовой смеси солей (Pierce, США) в ультрачистой деионизированной воде. Все растворы, использованные в экспериментах, готовили, используя ультрачистую воду (18.2 MОм × см), очищенную с помощью установки Simplicity UV (Millipore, Франция).

Для получения кавитационной воды использовали гидродинамический генератор (ГДГ), изготовленный в ООО "НПО "Курс" (Россия). ГДГ состоит из статора и ротора, изготовленных из пищевой нержавеющей стали. Основные параметры ГДГ: мощность электродвигателя 7,5 кВт, частота вращения ротора 4800 об/мин, объем рабочей камеры 0,3 л, число кавитации ~0,5. В процессе кавитационной обработки вода нагревалась до 62 °С. Фотоизображение установки на базе гидродинамического генератора представлено на рис.1.

формате PDF (1103Кб)