Напечатать документ Послать нам письмо Сохранить документ Форумы сайта Вернуться к предыдущей
АКАДЕМИЯ ТРИНИТАРИЗМА На главную страницу
Институт Продления Жизни - Публикации

А.Н. Стацкевич
Осмысление пройденного 3. Теория фиксированных зарядов Линга (ТФЗЛ)

Oб авторе


Мы уже упоминали, что обучение Линга цитофизиологии начиналось в известном на весь мир отделе физиологии Чикагского университета под руководством профессора Ральфа Джерарда. Подобно всем своим ровесникам, Линг был полностью убежден, что мембранная теория — это единственная путеводная звезда на небосклоне науки. Логично, что его первые серьезные публикации, написанные в соавторстве с профессорами Джерардом и Вудбери, были посвящены «мембранному потенциалу», сам термин и концепция которого рождены логикой мембранной теории.

Вскоре после проведения на кафедральном семинаре презентации «теории натриевого насоса», подготовленной Лингом исключительно на основе данных литературы, он уже и сам начал проводить несложные опыты. Его целью было проверить, на самом ли деле, как следует из этой теории, одновременное воздействие метаболических ядов и низкой температуры (0 °С) резко снижает уровень К+ в мышце лягушки. Результат оказался весьма неожиданным. Вплоть до окончания пятичасового эксперимента уровень К+ оставался неизменным. И чем дальше Линг углублялся в этом новом направлении, тем больше он сомневался в основах теории натриевого насоса.

Линг потратил массу времени и фантазии, чтобы придумать какой-нибудь альтернативный энергосберегающий механизм распределения К+ и Na+ между клеткой и средой взамен принятому на веру невероятно расточительному натриевому насосу. Проходили годы, а он все топтался на месте. Но однажды Линг копался в библиотеке Уэлча Медицинской школы Джонса Хопкинса в Балтиморе, и вдруг его осенило. Возникшая идея стала основой того нового подхода, который впоследствии был назван теорией фиксированных зарядов Линга (ТФЗЛ), явившейся первым шагом к созданию единой теории цитофизиологии — теории ассоциации-индукции (ТАИ). Суть этой теории будет изложена здесь, а также и в будущем.

Мысль о том, что калий внутри клетки адсорбируется предпочтительней натрия, была впервые высказана в 1908 году Гербертом Роуфом и Бенджамином Муром. Тем не менее, как уже подчеркивалось ранее, до появления ТФЗЛ ни они, ни кто-либо другой не предложил количественного молекулярного механизма, объясняющего столь странную способность клетки делать различие между этими столь близкими по свойствам ионами. Также никто не попытался объяснить, как белкам, — наиболее вероятным кандидатам на роль субстрата, избирательно связывающего К+ в присутствии Na+, — удается выполнять эту функцию в живой клетке, и почему неоднократные попытки воспроизвести это явление in vitro (в пробирке) неизменно проваливались. Никто не смог также объяснить на молекулярном уровне, почему способность к избирательной адсорбции (если она существует) мгновенно теряется при гибели клетки. Теория фиксированных зарядов Линга — есть результат попыток ответить на эти вопросы.



Теория избирательного накопления К+ в присутствии Na+

Для создания логически последовательной теории (ТФЗЛ) предпочтительной адсорбции К+ и сопряженных с этим явлений, о которых кое-что уже сказано выше, были введены три новые теоретические концепции (В библиотеке Лингу тогда пришла в голову лишь одна из них — под номером 3) :


1. Усиление ассоциации противоионов (или нейтральных молекул) с центром связывания, если он становится неподвижным, фиксированным

Эта концепция была представлена в 1952 году. Она заключается не в утверждении самого факта существования фиксированных зарядов, — он был установлен гораздо раньше, — а в том, что фиксированное состояние заряда приводит к такому усилению его взаимодействия со свободными противоионами, которое создает предельное насыщение пространства вокруг него этими противоионами (теория полной ассоциации), такими, например, как К+ или Na+. Именно эта концепция и отличает ТФЗЛ и ТАИ от всех остальных «теорий фиксированных зарядов» прошлого и настоящего. Ведь без предельного сближения противоионов избирательная адсорбция К+ в присутствии Na+, в соответствии с предложенной Лингом моделью избирательности (см. ниже п. 3) и соответствующих механизмов, которые будут рассмотрены позже, была бы попросту невозможна.

Под влиянием великих теорий ионной диссоциации Аррениуса, а также Дебая и Хюккеля, принято считать, что в разбавленном водном растворе (в клетке, например) одновалентные ионы одного электрического заряда и одновалентные ионы противоположного знака полностью диссоциированы вне зависимости от того, фиксирован ли один из этих ионов в пространстве или нет. В полном соответствии с верой во всемогущество ионной диссоциации, влиятельный датский ученый Кай Ульрик Линдерстрём-Ланг, занимавшийся химией белков и возглавлявший Карлсбергскую лабораторию в Копенгагене, описывал молекулу белка как эллипсоид, электрический заряд которого равномерно распределен по его поверхности, окруженный диффузным облаком противоионов, количество которых соответствует избытку зарядов противоположного знака на молекуле белка. По мнению Линдерстрёма-Ланга, белки не вступают в непосредственный контакт с противоионами. Этот пример покажет читателю, насколько резко точка зрения Линга, которая будет изложена ниже, выбивается из общего потока мнений.

Одной из двух названных Лингом в 1952 году причин усиления ассоциации противоионов при пространственной фиксации одного из них независимо от его знака было перекрытие электрических полей соседних фиксированных зарядов противоположных знаков. Это перекрытие — не что иное, как микроскопическая реализация закона макроскопической нейтральности.


Закон макроскопической электронейтральности.

Закон, гласящий, что у любого объекта макроскопических размеров в любой момент времени общее число положительных зарядов равно общему числу отрицательных зарядов. Даже весьма незначительное нарушение этого баланса зарядов привело бы к возникновению электростатического потенциала. Убедимся в этом на видоизмененном примере, приведенном Гугенгеймом [97, р. 330—331]. Представьте себе живую клетку сферической формы радиусом 0,1 мкм (10-6 м). Удалим из нее небольшое количество K+ — 10-18моль. В результате, внутри клетки появится избыток отрицательных зарядов, составляющий 10-18 от числа Фарадея, или 0,965 x 105 x 10-18 = 9,65 х 10-14 кулонов. Электрический потенциал ψ заряженной сферы радиуса r в водной среде определяется формулой ψ = Q/εr, где Q — электрический заряд, а ε - диэлектрическая проницаемость воды, равная 78,5 x 1,11 х 10-10 Кл/В·м = 8,72 x 10-9Кл/В·м при 25 °С. Подставив полученные значения, мы получаем ψ = (9,65 х 10-14)/(8,72 х 10-9 х 10-6) = 11 вольт. При этом разность электрических потенциалов, фактически регистрирующаяся в животных клетках, не превышает 0,1 вольт. Если предположить, что в нашей сферической клетке K+ содержится в обычной концентрации 100 ммоль/кг, его количество в нашей клетке должно составить (4/3) π r3 х 10-4 = 4,19 х (10-4)3х 10-4= 4,19 х 10-16 моль. Удаленное в нашем мысленном эксперименте количество калия (10-18 моль) составляет 10-18/(4,19 х 10-16) = 2,39 х 10-3, или всего лишь 0,239% от общего количества K+ в клетке. Как видим, стремление системы к электронейтральности не позволит нам удалить из клетки даже ничтожное, казалось бы, количество зарядов.


При перекрытии полей не только возрастает прочность связывания иона, но и диссоциировавший противоион надежнее удерживается на близком расстоянии от фиксированных ионов. Это пространственное ограничение его подвижности означает снижение энтропии диссоциации противоиона и увеличение, в конечном счете, вероятности его связанного состояния. Действительно, если К+ связывается с фиксированным анионом, окруженным фиксированными катионами, то энергия его связывания с анионом возрастает из-за того, что диссоциация в направлении к одноименным фиксированным зарядам становится менее энергетически выгодной. Кроме того, и достаточно плотное расположение фиксированных анионов также значительно увеличивает вероятность связанного состояния К+ или другого катиона.

Вторая причина усиления ассоциации, также высказанная Лингом в 1952 году, — чисто кинетическая по своей природе. Однако именно здесь и сейчас впервые будут детально изложены ее особые механизмы. Считается, что шанс образования ассоциированной пары катион-анион почти не зависит от того, фиксирован ли один из них в пространстве. Однако в случае фиксации одного из ионов вероятность диссоциации пары под ударами молекул воды, например, уменьшается как минимум вдвое из-за того, что фиксированная часть пары остается на месте, не движется навстречу другой молекуле, в результате скорость их столкновения значительно снижается (по меньшей мере, на 50%), соответственно снижается и вероятность того, что налетевшая молекула выбьет связанный катион. Результат, опять же, — усиление ассоциации. Обратите внимание, что первая причина (перекрытие полей) относится лишь к заряженным частицам (т. е. ионам), тогда как вторая (кинетическая) не зависит от заряда и, таким образом, относится к любому локальному акту адсорбции — ионов, воды и других веществ.

Теория усиления ассоциации противоионов (и нейтральных адсорбатов) с фиксированными центрами связывания в последующие годы неоднократно рассматривалась в публикациях Линга. Ее решающее значение для возникновения прочной ассоциации в живых системах отражено и в самом названии итоговой теории — теории ассоциации-индукции (ТАИ). Не успела она появиться на свет, как стало ясно, что факты, которые она предсказывает, уже имеются в литературе о состоянии ионов и воды в модельных системах. Вот один из них.

Керн продемонстрировал, что коэффициент активности Na+ в растворах натриевой соли изомасляной кислоты (СН3СНСООНСН3) концентрацией 12,5-200 мМ варьирует от 0,90 до 1,00, то есть не менее 90% Na+ находится в свободном состоянии. Если же мономеры изомасляной кислоты соединены в линейный полимер — полиакриловую кислоту (СН2СНСООНСН2)n, — то карбоксильные группы оказываются в этом случае зафиксированными в пространстве, вернее, их подвижность по сравнению с мономером, оказывается в этом случае значительно более ограниченной. Коэффициент активности Na+ в том же самом диапазоне молярных концентраций полимера падает до 0,168-0,315, то есть 68-83% ионов Na+ оказывается связанными карбоксильными группами полимера.


2. Теория белковых солевых связей и значение АТФ в их динамике

Как гласит ТФЗЛ, отрицательно заряженные β- и γ-карбоксильные группы изолированных нативных белков участвуют большей частью в образовании солевых связей с фиксированными катионами (например, с положительно заряженными ε-аминогруппами и гуанидиновыми группами остатков соответственно лизина и аргинина), что лишает их способности адсорбировать свободные катионы, в частности, К+. Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ), связываясь с кардинальными центрами адсорбции, играющими ключевую регуляторную роль, приводит к разрыву солевых связей между остатками аминокислот и освобождает фиксированные заряды соответствующих белков для взаимодействия с ионами К+ и другими заряженными частицами.

В этих ранних представлениях механизм действия АТФ сводится к тому, о чем уже писали Райзман и Кирквуд, когда объясняли, почему АТФ препятствует самосокращению или спонтанному укорочению сократительных белков (таких, как миозин), которые эту кислоту связывали: АТФ, связанная in vitro с белками, придает им значительный отрицательный заряд, который препятствует сворачиванию полипептидной цепи, удерживая ее в «спрямленном» состоянии. Позднее, в теории ассоциации-индукции, Линг предложил несколько иной (хотя и сходный) механизм. АТФ, бесспорно, является аккумулятором энергии. Ее решающее значение в поддержании избирательной адсорбции К+белками, согласно ТФЗЛ, объясняет, почему при повреждении или гибели клетки, когда метаболизм в ней замедляется или прекращается вовсе, прекращается и синтез АТФ, кардинальные центры адсорбции освобождаются от взаимодействия с АТФ, в белках снижается количество свободных для взаимодействия фиксированных зарядов, и К +выходит из клетки.


3. Электростатическая модель избирательного накопления в клетке К+ в присутствии Na+, созданная в 1952 году

Приняв во внимание явление диэлектрического насыщения, возникающее при электростатическом взаимодействии между фиксированным анионом и свободным одновалентным катионом в реальной среде, а не в вакууме, можно вычислить вероятность, с которой он может находиться на том или ином расстоянии от отрицательно заряженного атома кислорода (β- или γ-карбоксильной группы остатков соответствующих аминокислот (кривая 2 на рис.)). Резкое снижение относительной диэлектрической проницаемости среды при сближении заряженного центра и иона, также показано на рис. (врезка в правом верхнем углу). При удалении заряженных частиц друг от друга, между ними оказывается все больше и больше молекул воды, относительная диэлектрическая проницаемость, или постоянная, которой приближается к 80 (диэлектрическая постоянная показывает, напомним, во сколько раз взаимодействие между зарядами слабее в данной среде, чем в вакууме).


Увеличить >>>

Схема, объясняющая природу избирательной адсорбции К+ в присутствии Na+ фиксированным анионом. Эта модель впервые представлена в 1952 году как составная часть ТФЗЛ. При расчетах учтено не только расстояние между зарядами, но и снижение относительной диэлектрической проницаемости среды по мере сближения зарядов (показано на врезке). Кривая 2 показывает зависимость вероятности нахождения одновалентного катиона (к примеру, К+ или Na+) на определенном удалении от кислородсодержащей кислотной группы (О, в левом нижнем углу графика) в зависимости от расстояния между их центрами (в Е, ось абсцисс). О — кислород карбоксильной группы остатка бикарбоновой аминокислоты. В нижней части рисунка схематически изображены гидратированные ионы Na+ и К+. Обратите внимание, что лишь гидратированный ион К+, имеющий меньший радиус, может войти в «область высокой вероятности ассоциации» с атомом кислорода (3-4 Е) и, в результате, избирательно адсорбироваться, тогда, как центр более крупного гидратированного иона Na+ остается за пределами этой области (дальше 4 Е от атома кислорода).


В нижней части рис. приведены диаметры гидратированных ионов — К+, меньшего по размеру, и на 40% более крупного иона Na+. Обратите внимание, что гидратированный ион К+ способен подойти так близко к фиксированному аниону, что вероятность его захвата будет гораздо больше, чем у Na+, отделенного от аниона более толстой гидратной оболочкой. В этом и кроется секрет избирательного связывания К+, которому присутствие Naпомехой быть не может.

То, что изображено на рис., — первый количественный молекулярный механизм избирательной адсорбции К+ в присутствии Na+. Прежде чем перейти к более подробному описанию этого механизма, хотелось бы выразить его простыми словами: из-за того, что фиксированный анион и К+ разделяет меньшее расстояние, чем в случае с Na+, ионы К+ оказываются в области с большей напряжённостью электростатического поля не только в силу закона Кулона, но и из-за меньшего значения диэлектрической постоянной среды. В результате ион К+ адсорбируется на β- и γ-карбоксильных группах более прочно по сравнению с ионом Na+, в чем и заключается количественный молекулярный механизм избирательного накопления клетками К+ в присутствии Na+, не требующий непрерывного потока энергии для поддержания асимметричного распределения ионов между клеткой и средой.

Необходимо отметить, что миозин мышечных волокон несет множество β- и γ-карбоксильных групп (как и другие белки, сходные с ним в этом отношении). При адсорбции АТФ на регуляторные кардинальные центры миозина количество β- и γ-карбоксильных групп, способных связывать либо К+, либо Na+ значительно возрастает. Но поскольку размеры гидратированного иона К+ меньше, чем Na+, адсорбция первого энергетически более выгодна. В результате К+ избирательно накапливается клеткой, в отличие от Na+.

Остается добавить, что именно с этой мысли в 1952 году начались ТФЗЛ и ТАИ. Предложенные тогда механизмы остаются в силе и по сей день.

Работа над экспериментальной проверкой ТФЗЛ заняла более 40 лет. Подробное описание экспериментальных подтверждений ТФЗЛ и доказательств положений ТАИ по понятной причине занимает чрезвычайно много места и выходит за рамки скромных возможностей данной статьи. Кроме того, вдумчивое ознакомление с подобным описанием потребовало бы от читателя очень серьезных умственных усилий, упорства, специальных знаний, а главное — желания разбираться в скучной науке, изобилующей цифрами и графиками. Поэтому мы просто кратко резюмируем все результаты:

1. Структурой, обеспечивающей избирательное накопление К+ в присутствии Na+, является вовсе не клеточная мембрана с ее гипотетическими насосами, а протоплазма в целом.

2. Избирательной адсорбции ионов щелочных металлов β- и γ-карбоксильными группами так называемых «нативных» (т.е. фактически мертвых) глобулярных белков in vitro (в пробирке) препятствует образование в таких белках солевых связей между фиксированными анионами и фиксированными катионами (своего рода трупное окоченение на молекулярном уровне).

3. Особенности электропроводности клеток в покое, низкая мобильность внутриклеточного К+, данные рентгеновского микроанализа, а также коэффициенты активности К+, измеряемые К+-селективными микроэлектродами — все указывает на связанное состояние клеточного К+.

4. Исследования конкурентных отношений между одновалентными катионами щелочных металлов, обладающих различными характеристиками ближнего взаимодействия, доказали, что связывание обеспечивается прямым взаимодействием «один ион — один адсорбционный центр».

5. Обработка карбодиимидом, приводящая к исчезновению β- и γ-карбоксильных групп, а также титрование центров адсорбции доказывает, что внутриклеточный К+ связывается β- и γ-карбоксильными группами остатков дикарбоновых аминокислот, как это и следует из ТФЗЛ (и ТАИ).

6. Авторадиография, просвечивающая электронная микроскопия (на различных препаратах, включая тонкие лиофилизированные срезы мышечных волокон), дисперсионный рентгеновский микроанализ, как и более ранние методы внутриклеточного осаждения калия — все они свидетельствуют, что К+ в поперечнополосатых мышечных волокнах адсорбирован именно на β- и γ-карбоксильных группах, принадлежащих соответственно остаткам аспарагиновой и глутаминовой кислот белка миозина, особенно в той части его молекулы, которая расположена между Н-зоной и краем А-диска. Клеточный К+ адсорбируется также белками Z-линии, хотя и в меньшем количестве, но зато с высокой плотностью.

7. Изменение уровня К+ вдоль волокна портняжной мышцы лягушки, начиная с усеченного конца, сопряжено с соответствующим изменением уровня АТФ. Равновесные концентрации К+ в мышечных волокнах, которые подверглись действию 10 разных токсинов с разной степенью ингибирования метаболизма:

  • o глицериновый альдегид

  • o малоновая к-та — кальциевая соль малоновой кислоты в больших количествах содержится в корнеплодах свеклы

  • o арсенит — небезызвестный Фаулеров раствор (на основе мышьяка), «общетонизирующее средство»

  • o парахлормеркуриобензоат

  • o йодацетат

  • o азид — газообразующий компонент во многих системах подушек безопасности

  • o хлопромазин — он же знаменитый Аминазин, входящий в перечень так называемых «жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов»

  • o цианид — кто же не знает, что  это такое?

  • o 2,4-динитрофенол — детонирующее вещество динамита и, заодно, эффективный жиросжигатель (http://dnp.h11.ru/) и непревзойденный ускоритель метаболизма

  • o О-йодозобензоат

также коррелируют с уровнем АТФ в этих мышцах: чем меньше в клетке АТФ, тем ниже в ней содержание К+. Это полностью подтверждает постулат ТФЗЛ (и ТАИ), что именно присутствие адсорбированной на белках АТФ определяет количество К+, избирательно адсорбируемого β- и γ-карбоксильными группами миозина и других внутриклеточных белков.


Как уже говорилось, ТФЗЛ — это тот центр кристаллизации, из которого выросла теория ассоциации-индукции, основные положения которой будут подробно рассмотрены в дальнейшем. А сейчас пришло время рассказать еще об одной вспомогательной теории — теории многослойной организации поляризованной воды в клетке (ТМОПВ), которая была включена в состав ТАИ через 3 года после выхода в свет ее первой версии.


Подготовлена с использованием материалов книги Гильберта Линга "Физическая теория живой клетки"


А.Н. Стацкевич, Осмысление пройденного 3. Теория фиксированных зарядов Линга (ТФЗЛ) // «Академия Тринитаризма», М., Эл № 77-6567, публ.18008, 26.04.2013

[Обсуждение на форуме «Публицистика»]

В начало документа

© Академия Тринитаризма
info@trinitas.ru