Напечатать документ Послать нам письмо Сохранить документ Форумы сайта Вернуться к предыдущей
АКАДЕМИЯ ТРИНИТАРИЗМА На главную страницу
Дискуссии - Наука

Ю.Д. Иванов, В.Ю. Татур, А.В. Глухов, В.С. Зиборов
Нанопроволочный биосенсор для регистрации биомолекул

Ю.Д. Иванов
Oб авторе - В.Ю. Татур
А.В. Глухов
В.С. Зиборов


Нанопроволочные биосенсоры начинают находить широкое применение для быстрого скрининга белок-белковых, белок-нуклеиновых взаимодействий, а также для регистрации взаимодействий нуклеиновых кислот. Они являются перспективными устройствами для ранней серологической диагностики заболеваний из-за их чрезвычайно высокой концентрационной чувствительности, находящейся в диапазоне концентраций, ниже фемтомолярной. Такие устройства обладают высоким быстродействием и позволяют проводить регистрацию взаимодействий в режиме реального времени. Нанопроволочный чип представляет собой полевой нанотранзистор, в котором поверхность нанопроволочки является виртуальным затвором и обращена в раствор аналита с заряженными биомолекулами. Данная работа посвящена обсуждению возможности регистрации биомолекул в субфемтомолярном диапазоне концентраций, а также возможному механизму, объясняющему такой низкий концентрационной предел детекции кооперативным эффектом от биомолекулярных комплексов, формирующихся на поверхности нанопроволочного чипа вблизи нанопроволоки.


Ключевые слова: нанопроволока, нанолента, молекулярный детектор, высокочувствительная детекция белка, социально-значимые заболевания, биосенсорный анализ


Нанопроволочные детекторы – это устройства, под которыми подразумевают в основном приборы, позволяющие проводить детекцию биомакромолекул с помощью наноэлектронных устройств, представляющих из себя матрицу полевых транзисторов, в качестве затвора в которых используются нанопровода (наноленты, нанопроволоки) [1-2].

В таких приборах чувствительным элементом является нанопроволока, являющаяся n- или p-каналом полевого нанотранзистора, поверхность которой обращена в раствор аналита и является виртуальным затвором. Принцип действия такого устройства заключается в следующем. При попадании заряженной макромолекулы (на примере белка, нуклеиновой кислоты) на поверхность нанопроволоки должно наблюдаться изменение проводимости между стоком и истоком полевого транзистора. Это изменение проводимости регистрируется в реальном времени с помощью электронной системы. В качестве макромолекул в диагностических целях используются белковые маркеры, микроРНК, кольцевые РНК и другие макромолекулы, ассоциированные с социально-значимыми заболеваниями. Для обеспечения биоспецифической детекции поверхность чипа с нанопроволочного детектора функционализируется зондами, которые специфически распознают макромолекулы-мишени.

Нанопроволоки в нанопроволочных биосенсорах, как правило, имеют размеры в нанометровом масштабе, соизмеримым с размером макромолекул. Нанометровый масштаб позволяет повышать чувствительность за счет повышения отношения поверхность/объем. К примеру, нанопроволочный детектор имеет размер (диаметр – нанопроволока, толщина - нанолента) порядка 10 нм – 10 мкм. Как правило, нанопроволочные детекторы изготовляются в виде матрицы полевых транзисторов. Таких транзисторов может быть до 10 и более на одном чипе. Экспериментально измеренная концентрационная чувствительность таких детекторов, как правило, достигает 10-17 -10-15 М [1-2].

Такая чувствительность необходима для выявления онкологических и инфекционных заболеваний на ранней стадии [3]. Однако, теоретическая база экспериментального достижения такого предела детекции с помощью существующих в настоящее время моделей, основанных на регистрации макромолекул непосредственно на поверхности нанопроволоки, пока находится в стадии формирования. Данная работа посвящена обсуждению возможного механизма, обеспечивающего экспериментальное достижение такого фемтомолярного и субфемтомолярного предела чувствительности с помощью нанопроволочного детектора.

При анализе концентрационного предела детекции нанопроволочных детекторов возникает существенный вопрос, связанный с теоретическим обоснованием экспериментальных результатов. Для регистрации биомакромолекул, раствор аналита с этими макромолекулами вносится в объем измерительной кюветы на поверхность нанопроволоки. При этом происходит фишинг биомакромолекул из большого объема кюветы на поверхность нанопроволоки. где и формируются биоспецифические комплексы. Обычно считается, что сигнал нанопроволочного детектора вызывается попаданием заряженной молекулы на поверхность нанопроволоки. Учитывая, что радиус Дебая в буферных растворах, обычно используемых в этих детекторах, меньше 10 нм (концентрация буфера порядка нескольких миллимоль на литр), это означает, что при таком механизме заряженная молекула должна быть на расстоянии несколько нм вблизи нанопроволоки. С другой стороны, этот механизм вызывает вопрос, связанный с тем, что вероятность реализации такого процесса достаточно низкая.

Для подтверждения этого приведем оценочный расчет для чипа, выполненного в виде матрицы с 200-ми нанопроволоками, с характерными размерами (ширина = 20 нм (взята для оценки сверху), длина=2 мкм), который используется на практике в нанопроволочных биосенсорах [1]. Сначала оценим количество биомакромолекул, которое находится в нанопроволочной измерительной ячейке, дном которой является этот чип. Предположим, объем аналита составляет V = 50 мкл (в случае микроканального чипа при скорости прокачки 0.15 мЛ/час и времени регистрации порядка 0.3 часа, как например, в статье [1]) или как в случае с кюветой с перемешиванием [2]. В таком объеме при концентрации C=10-15 – 10-17 М содержится число N=NACV =3·104 – 3·102 биомакромолекул (штук). Таким образом, при субфемтомолярной концентрации C = 10-16 М в этом объеме содержится 30 молекул. Предположим, что на чипе может быть порядка 200 нанопроволок [1] – 10 [2], то можно сделать вывод, что теоретически на каждую нанопроволоку может попасть число молекул 1/200 N, то есть попасть порядка 15 [1] - 300 [2] молекул при концентрации 10-16 М.

Предположим, что поверхность нанопроволоки модифицирована непрерывным слоем зондов для простоты рассмотрения. Модификация нанопроволоки может производиться за счет нанесения раствора зонда определенного объема V на активированную площадь поверхности Sd области нанопроволки. При этом модификации может подвергаться дополнительно более существенная по размеру область Sd (которая включает в себя и гораздо меньшую площадь нанопроволоки), куда растекается капля с зондами при модификации нанопроволоки. Учтем, что не все биомакромолекулы-мишени могут попасть на нанопроволоку в процессе их фишинга, а могут быть потери в их доставке к нанопроволоке из-за того, что они могут адсорбироваться вдали от нанопроволоки, в частности на площади Sd, около нанопроволоки на матрице, так как размер наносимой капли с зондами при модификации нанопроволоки, как правило, превышает размер нанопроволочки. Оценим потери, связанные с этим случаем.

Площадь нанопроволоки в грубой оценке составляет SW~0.04 мкм2[1] - 30 мкм2[2]. В то же время, в процессе модификации нанопроволоки, при нанесении раствора зонда на поверхность проволоки в случае работы [1] можно оценить, что при нанесении раствора с помощью роботараскапывателя, диаметр капли с раствором зонда может быть гораздо больше с площадью капли Sd. Отсюда следует, что доля иммобилизованных на поверхности нанопроволоки зондов составляет F=SW/Sd. Отсюда, в свою очередь, следует, что количество биомакромолекул, которые могут попасть на нанопроволоку при равномерном распределении их по площади капли на поверхности чипа составляет в F (порядка 0.01 в случае работы [1] с учетом того, что между 20 нм проводами расстояние 2 мкм, или 0.1 в случае работы [2]) раз меньше. Таким образом, учитывая, что размер нанопровода меньше размеров зоны чипа, к которой пришиваются молекулы-зонды (эта зона формируется в месте капли раствора с молекулами наносимых зондов в процессе их пришивки к поверхности нанопровода), то количество молекул мишеней, попадающих именно на сам нанопровод в субфемтомолярной концентрации, может быть понижено, по сравнению с количеством исходно– содержащихся молекул N мишеней в аналите на порядок и меньше, что затруднительно для регистрации, так как в этом случае регистрация уже должна наблюдаться в режиме регистрации, близком к режиму счета единичных молекул. Однако, большое количество работ, посвященное регистрации с такой концентрацией, указывает, что этот предел достаточно легко реализуем с помощью нанопроводного детектора, в частности в работе [1] указывается на субфемтомолярный предел детекции, то есть на уровне 5·10-16М, а в работе [2] сообщается о достижении на уровне даже 10-17. Это явление, как мы предполагаем, связано с кооперативным эффектом, обусловленным формированием сетки связей через водный каркас приповерхностного слоя, который участвует в передаче влияния заряда от места образования комплекса на поверхность нанопровода чипа с иммобилизованными молекулами.

Концентрационная чувствительность должна быть не лучше, чем 10-15 М, если нанопроволочный детектор может чувствовать одну молекулу. В то же время, экспериментально наблюдается сигнал от макромолекул при концентрации 10-17 М. Это может указывать на то, что механизм детекции основан на том, что имеется кооперативное влияние всех макромолекул, специфичных к зондам как нанопроволоки, так и в остальной области Sd на месте капли, которая наносилась в области нанопроволоки. Этот кооперативный эффект может быть обусловлен распространением влияния от комплексообразования биомакромолекул с иммобилизованными зондами в области места адсорбции капли Sd, а не только поверхности нанопроволоки, посредством водной среды. Учтем, что вода – это гетероструктурная среда, которая представляет собой, согласно последним данным литературы, неравновесную среду в плане спинового состояния, состоящую из пара-орто изомеров воды [4]. Более того, спин-селективное взаимодействие параизомеров Н2О с белками в водных растворах позволяет ожидать, что гидратная оболочка образована преимущественно пара-изомерами, как было отмечено Першиным и соавторами. Недавно ими было установлено, что равновесное отношение орто/пара 3:1, справедливое для газов при комнатной температуре, смещается в воде в сторону увеличения числа параизомеров Н2О более чем в 2 раза и любое внешнее воздействие может смещать это равновесие. Таким образом, в литературе было показано, что вода неравновесная, в смысле спиновой температуры, жидкость. Совокупность изложенных экспериментальных фактов показывает, что вода в гидратных слоях биомолекул и поверхности чипа структурирована и имеет структуру льда. Жесткость льдоподобной структуры оболочки поддерживает форму белка и препятствует его деформации (сворачиванию в клубок с минимальной поверхностной энергией в соответствии с термодинамикой [4]. Согласно помянутым выше работам, в воде формируются гидратные слои вдоль поверхности чипа и иммобилизованных зондов. Очевидно, в водной среде формируется пространственная сеть, включающие в себя поверхность с зондами. Есть гидратная оболочка и у добавляемых биомакромолекул. Принимая во внимание существование льдоподобных структур типа Ih в воде и гидратных слоях, при формировании комплексов может меняться льдообразная структура в области нанопроволоки и окружающей её площади Sd с зондами. При этом происходит перераспределение электронной плотности вдоль сетки этих связей от места формирования комплексов к поверхности нанопроволоки. Заряженные молекулы, например, индуцируют из-за этого появление повышенной электронной плотности в области нанопроволоки через такую структуру за счет кооперативного эффекта. Повышение количества комплексов биомакромолекул в области места нанесения капли с иммобилизованными зондами из-за фишинга биомакромолекул приводит к включению дополнительных участников в кооперативном влиянии всех комплексов на поверхности Sd на проводимость нанопроволоки. Таким образом, можно сделать вывод, что этот кооперативный механизм позволяет объяснить результаты по регистрации сверхмалых концентраций (фемтомолярных) комплексов в нанопроволочных нанобиосенсорных системах. Дополнительное рассмотрение квантовой конверсии пара/орто - изомеров воды, которое является медиатором модулирования сетки водородных связей с переходом при этом орто-H2O молекул в пустоты каркаса сетки гидратного слоя и повышения за счет этого проводимости [4] при образовании комплексов в зоне гидратного слоя в области Sd с возрастанием в связи с комплексообразованием в этой области размеров макромолекулярных кластеров до микронных масштабов (размер микронного масштаба, который может образовываться для контактной границы воды с гидрофильной поверхности макромолекул) приводит к следующему выводу. Такое модулирование приводит к cоответствующему возрастанию скорости диффузии H3O+ и OH- и, соответственно, модулированию электрической проводимости (согласно работам, Першина С.Г.), и дает возможность дополнительного дальнодействующего (кооперативного) влияния заряженных молекул при комплексообразовании в области Sd на зарядовое состояние нанопроволочки.

Кооперативный эффект, описанный здесь, проявляется не только в нанопроволочных системах, но и при функционировании ферментативных нанообъектов, свидетельствующей о явлениях квантовой запутанности водно-биологических систем, где может реализовываться оперирование элементарными ячейками информации – кубитами, имеющими значения одновременно 0 и 1. Физическими системами, реализующими кубиты, могут быть любые объекты, имеющие два квантовых состояния. В нашем случае система, реализующая кубиты может быть спиновое состояние водноферментных доменов с определенным соотношением орта/пара состояний воды в этих доменах. Запутанность кубитов в водно-ферментной системе может осуществляться благодаря взаимодействию водно-ферментных доменов, корреляция между которыми приводит к единому квантовому состоянию. Квантовая запутанность для макрообъектов уже получила свое подтверждение в экспериментальных работах, опубликованных в журнале Science [5].

В работе поднимается вопрос об экспериментально измеренном сверхнизком субфемтомолярном концентрационном пределе детекции для нанопроволочных биосенсоров. Обсуждается, что механизм нанопроволочной детекции может быть основан на кооперативном эффекте водно-белковых структур. Такой механизм позволяет обосновать чувствительность нанопроволочных систем с маленьким размером нанопроволочки, расположенной на большой поверхности чипа, на которую осуществляется фишинг биомакромолекул из еще гораздо большего по размеру объема аналита в субфемтомолярном диапазоне концентраций.

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021-2030 годы). Работа выполнена при поддержке Фонда перспективных технологий и новаций.


Список использованных источников

1. Zheng G. et al. Multiplexed electrical detection of cancer markers with nanowire sensor arrays//Nature biotechnology. – 2005. – Vol. 23. – №. 10. – P. 12941301.

2. Malsagova K. A. et al. SOI-Nanowire Biosensor for the Detection of Glioma-Associated miRNAs in Plasma //Chemosensors. – 2020. – Т. 8. – №. 4. – С. 95.

3. Rissin D. M. et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations //Nature biotechnology. – 2010. – Vol. 28. – №. 6. – P. 595-599.

4. Першин С. М. Эффект Коновалова в водных растворах низких концентраций: роль спиновых орто-пара-изомеров Н2О //Доклады Академии наук. — 2014. – Т. 455. – №. 1. – С. 44-47.

5. Kotler S. et al. Direct observation of deterministic macroscopic entanglement //Science. – 2021. – Vol. 372. – №. 6542. – P. 622-625.



NANOWIRE BIOSENSOR FOR REGISTRATION OF BIOMOLECULES

Nanowire biosensors begin to find wide application in rapid screening of protein-protein and protein-(nucleic acid) interactions, and also for registration of nucleic acid interactions. They represent promising devices for early serological diagnosis of diseases owing to their extremely high concentration sensitivity, with a detection limit lower than the femtomolar one. Such devices have high operation speed, and allow one to conduct registration of the interactions in real time. Nanowire chip represents a field-effect transistor, in which the surface of the nanowire serves as a virtual gate and is subjected to the analyte solution containing charged biomolecules. In this work, registration of biomolecules within subfemtomolar range of concentrations and possible mechanism, which explains such a low concentration limit of detection by a cooperative effect of biomolecular complexes formed on the surface of a nanowire chip near the nanowire, are considered.

Key words: nanowire, nanoribbon, molecular detector, highly sensitive protein detection, socially significant diseases, biosensor analysis.


Заметки Ученого, 2021, №7, часть 2, с. 56-61 


Иванов Юрий Дмитриевич

Д-р биологических наук, профессор, заведующий лабораторией, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» (ИБМХ)


Глухов Александр Викторович

Заместитель генерального директора по научной работе, Акционерное общество "Новосибирский завод

полупроводниковых приборов с ОКБ"


Зиборов Вадим Серафимович

Кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Объединенный институт высоких температур РАН (ОИВТ РАН)



Ю.Д. Иванов, В.Ю. Татур, А.В. Глухов, В.С. Зиборов, Нанопроволочный биосенсор для регистрации биомолекул // «Академия Тринитаризма», М., Эл № 77-6567, публ.27241, 17.07.2021

[Обсуждение на форуме «Публицистика»]

В начало документа

© Академия Тринитаризма
info@trinitas.ru